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陈东科,许宏涛/医院
马拉色菌为一种嗜脂性酵母，属人体皮肤正常的菌群，也是一种条件致病真菌。到20世纪90年代中期，有学者基于形态学、超微结构、生理生化特征以及分子生物学的研究，将马抟色菌分为厚皮马拉色菌(Malasseziapachydermatis)、合轴马拉色菌(Malasseziasympodialis)、糠秕马拉色菌(Malasseziafuorur)、钝形马拉色菌(Malasseziaobtusa)、球形马拉色菌(Malasseziaglobosa)、限制马拉色菌(Malasseziarestricta)和斯洛菲马拉色菌(Malasseziaslooffiae)7个。近年来，随着分子生物学研究的进展尤其是核糖体DNA测序和随机扩增多态性分析在真菌分型上的应用，又有皮肤马拉色菌(Malasseziadermatis)、马属马拉色菌(Malasseziaequi)、同本马拉色菌(Malasseziajaponica)、大和马拉色菌(Malasseziayamatoensis)、Malassezianana及Malasseziacaprae6种马拉色菌被发现，现已报道的马拉色菌有13个种。然而后6种新的马掩色菌种系发生上与合轴马拉色菌密切相关，还需要对其特征进行更多的研究以确认其为新。在易感因素的影响下，马拉色菌与花斑癣、毛囊炎、脂溢性皮炎、特应性皮炎及某些银屑病等疾病的发生密切相关，常侵袭皮肤角质层引起浅部真菌病。在已公认的马拉菌7个种中，糠秕马拉色菌较为常见，其最常导致的疾病为花斑糠疹，糠秕马拉色菌还可引起败血症、腹膜炎、肺炎等。本研究探讨了临床患者下呼吸道标本中糠秕马拉色菌的分离及鉴定情况。
材料与方法
一、材料
1．标本来源：标本采自年3月至年9月医院呼吸道感染患者的气管吸痰份。直接涂片经革兰染色镜检，镜下找到形态疑似马拉色菌为入选标准，剔除同一患者的重复标本，共份疑似标本。糠秕马拉色菌ATCCl医院喻华老师馈赠，球形马拉色菌CBS医院抗生素研究所胡付品博士馈赠。
2．试剂与仪器：科玛嘉念珠菌显色培养基（CHROMagarTMCandida)为法国柯玛嘉产品，沙保弱琼脂(Sabourauddextroseagar，SDA)购自北京陆桥技术有限责任公司。糠秕马拉色菌分离培养基(筛选平板)为加1％吐温60的科玛嘉念珠菌显色培养基(吐温．科玛嘉平板)。4％蓖麻油的SDA平板，加2％吐温20、40、60、80的SDA，加0.5％吐温40和0.5％吐温60的SDA(菌株传代用)，均为本实验室配制。吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、七叶苷斜面培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。触酶试剂ID—ASE、革兰染色液购自法国生物梅里埃公司。派克标准墨水(Blue-Blackink)为上海派克笔有限公司产品。蓖麻油为湖北科田药业有限公司产品。橄榄油为西班牙亿芭利橄榄油公司产品。
二、方法
1．标本筛选：痰标本经革兰染色、镜检，发现有可疑为马拉色菌(革兰染色阳性、成群圆形或卵圆形、单出芽、芽生孢子与母孢子连接处可见颈圈样结构)的标本，另涂片作派克墨水染色，镜检确认(念珠菌孢子不着色)后接种马拉色菌筛选平板。
2．菌株分离培养：挑一环镜检阳性的标本接种于吐温科玛嘉平板上，用接种环密涂，于35℃大气环境，孵育2d开始观察。挑取小圆。白色至粉红色，突起，较干燥，有特殊芳香气味的菌落涂片，用派克墨水染色后镜检，疑似菌株在加0.5％吐温40和0.5％吐温60的SDA平板上进行纯培养。孵育至10d无马拉色菌生长为阴性。
3．菌株鉴定：鉴定过程以糠秕马拉色菌标准菌株ATCCl和球形马拉色菌CBS做质控对照。
4．形态学鉴定：取分离菌株涂片，用ml／L派克墨水染色后镜下观察形态为卵圆形出芽孢子。
5．沙保罗培养基生长试验：将分离菌种接种于SDA培养基上，35℃培养14d，记录生长情况。
6．吐温试验：(1)打孔法：配制0.5麦氏浓度待检菌液，密涂直径90lnmSDA平板，以直径3lnm的无菌钻孔器在平板四周打4个孑L，分别加入％吐温40、吐温60、吐温80，35℃培养3d后观察生长情况。(2)点种法：配制0.5麦氏浓度待检菌液，吸取菌悬液5出分别滴加于含2％吐温20的SDA培养基上，35℃培养5d，记录结果，明显生长为阳性，不生长为阴性。
7．七叶苷分解试验：将待检菌接种于七叶苷琼脂斜面培养基上，并在斜面上滴l滴橄榄油，35℃培养3d，观察培养基的颜色变化。培养基斜面变黑者为阳性，不变色为阴性。
8．过氧化氢试验：滴加ID-ASE触酶试剂l滴于吐温一科玛嘉平板上的待检菌菌落上，立即观察，产生气泡则为阳性，不产生气泡为阴性。
9．吐温沉淀试验：在加0.5％吐温40和0.5％吐温60的SDA培养基上观察马拉色菌的菌落周围，如果出现白色沉淀圈，即为吐温沉淀试验阳性。
10．蓖麻油试验：(1)打孔法：配制0.5麦氏浓度待检菌液，密涂直径70mmSDA平板，以直径3mm的无菌钻孔器在平板上打孔，在孔内加入蓖麻油l滴，35℃培养5d后观察生长情况。(2)点种法：配制5麦氏浓度待检菌液，吸取菌悬液l“l滴加于含4％蓖麻油的SDA培养基上，35℃培养5d，记录结果，明显生长为阳性，不生长为阴性。
11．18srRNA基因序列分析：随意抽取5株不同时间分离的马拉色菌菌株进行基闪序列分析，以糠秕马拉色菌标准菌株ATCCl做质控对照。具体方法参照文献[12]进行，获得序列提交美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI)GenBank数据库(北京最好的白癜风医院北京中科白电风医院